过表达细胞系构建PCR检测试剂盒操作步骤

ningxueqin · 发表于 2024-05-15 21:31:28

　　过表达细胞系构建PCR 由变性——退火——延伸三个基本反应步骤构成。
　　准备好各种试剂和 PCR 仪，就可以开始 PCR 实验：将各种试剂混合并按照说明书设置 PCR 反应。一般 PCR 循环如下：
　　1、起始步骤：这对于热启动 PCR 而言是必须的，将反应混合液加热至 94——98 ℃ 以激活 DNA 聚合酶。这一步的时间取决于所选用的 DNA 聚合酶。
　　2、变性步骤：DNA 本身是双链结构，而 DNA 扩增需要引物与单链 DNA 模板相结合。在这一步，反应混合液被加热至 94——98 ℃ 保持 20——30 秒以破坏双链间的氢键以便释放出单链 DNA。这是 PCR 循环中的第一步。
　　3、退火步骤：变性之后，DNA 模板以单链的形式在反应混合液中存在。因为反应体系中的引物与 DNA 模板互补，当反应温度降至 50——65 ℃ 时，引物与互补的序列形成氢键。退火温度主要取决于引物的 Tm 值，通常比引物 Tm 值低 3——5 ℃。这一步通常维持 20——40 秒，而聚合酶会结合至引物-模板双链处开始 DNA 合成。
　　4、延伸步骤：在这一步，DNA 聚合酶开始 DNA 合成，因此这一步的温度选取的是 DNA 聚合酶的最优温度。通常我们选用 72 ℃，但某些 DNA 聚合酶的最适温度是 68 ℃。这一步与体内的 DNA 复制很相似：DNA 聚合酶按照碱基互补规律将 dNTPs 加到引物的 3’ 末端最终得到新的 DNA 双链片段。延伸时间取决于目的 DNA 片段的长度和 DNA 聚合酶的合成能力。一般而言 DNA 聚合酶每 60 秒能够合成 1 kb 长度的 DNA。
　　5、循环：第 2 步至第 4 步称为一个循环。每次循环之后 DNA 的量均是前一次的两倍。通常一次 PCR 反应进行 30——35 个循环。在前几轮的 PCR 循环过程中 PCR 产物的量以指数速率增长，但是到了反应后期随着 dNTPs 和引物的量的减少以及 DNA 聚合酶的失活，反应速率逐渐下降，因此 PCR 反应的产量也受到了限制。
　　6、最后的延伸步骤：当 30——35 个循环结束后，我们通常会以 68——74 ℃ 延伸 5——10 分钟，这是希望使反应体系中残留的单链 DNA 全部反应完毕。
　　保存温度：通常我们设置 4——10 ℃ 为反应后 PCR 产物的保存温度。
　　每完成一个循环需 2——4 分钟，2——3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期 (Plateau) 所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。PCR 的反应动力学 PCR 的三个反应步骤反复进行，使 DNA 扩增量呈指数上升。

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