挑选无菌制剂灌装荧光素参考的各个方面阐述

ningxueqin · 发表于 2024-05-13 22:59:37

　　在流式细胞术实验，无菌制剂灌装各种荧光素标记的抗体是必须的。那么荧光素该如何选择呢，通常会参考以下5个方面：
　　1. 流式细胞仪配置：仪器需满足激光管可激发相应的荧光素且可同时检测所需的荧光。附常见荧光素的激发波长和发射波长：
　　2. 染料的亮度与抗原表达量相匹配：低表达抗原，推荐使用亮荧光染料；高表达抗原，推荐使用弱荧光染料。
　　3. 荧光染料重叠最小化：尽量选择光谱重叠小的荧光素，如FITC/PE-Cy7；选择不同激光激发的荧光素，如FITC/APC，PE/APC。
　　光谱重叠严重的荧光素同时检测会导致荧光溢漏，需调节补偿。
　　4. 避免复合染料联合使用带来的假阳性：常见的复合染料有PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PerCP-Cy5.5、APC-Cy7等，复合染料的信号衰退会降低APC或PE的灵敏度。如果出现信号衰退，则采取下面措施：
　　1）、减少样本暴露于光、高温或固定剂；
　　2）、选择染料时考虑：复合染料的信号衰退会降低APC或PE的灵敏度，避免染料和其衍生物在同一细胞上标记。选择更稳定的tandem-dye（PerCp-Cy5.5）；
　　3）、如果样本需固定，选择稳定、可有效阻止复合染料信号衰退的固定剂多聚甲醛：冰上固定10min，离心除去多聚甲醛，将样品重悬于PBS中。
　　5. 尽量使用红色激光激发自发荧光高的样本：每种细胞群都有不同水平的自发荧光。所有的荧光通道均可观察到自发荧光，但自发荧光强度在波长较长时迅速降低。对自发荧光较强的细胞，选择红光激发，发射波长长的荧光素（如APC）可得到较好的S/N比值；对自发荧光比较弱的细胞，发射波长长的荧光素对S/N提高没有明显的改善，可选用FITC。

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