聚合酶链反应简称PCR(Polymerase Chain Reaction)，是以DNA半保留复制机制为基础，发展出的体外酶促合成、扩增特定核酸片段的一种方法。
& ~" k6 E" l' m0 e# m6 v 一、模板和底物1 A H# \3 z9 z$ y% {3 Q9 E+ S+ t
DNA复制是模板依赖性的，必须以亲代DNA链作为模板，稳定细胞系构建亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。同时，DNA复制需要以四种脱氧核糖核苷酸，即dATP、dGTP、dCTP、dTTP，为底物合成子代DNA。
/ d- A9 R8 ?9 { 在体外进行DNA复制时，模板和底物均可通过人工添加解决。
0 Z7 M J% j; w: D) x 二、引物) j) t) A {- d) \' l2 L, {+ W
DNA聚合酶必须以一段具有3’端自由羟基（3’-OH）的RNA作为引物，才能开始合成子代DNA链。
$ w$ ^/ ]$ K, q' s# [ 在体外进行DNA复制时，可以人工合成具有特定序列的寡核苷酸作为引物，该引物序列与进行扩增的目的核酸片段互补匹配，从而开始目的片段的扩增。- ^ B" q8 R+ J* c' Y' Y" a' n
因为引物的碱基序列需要与目的片段相匹配，在合成引物之前，必须首先已知目的片段的碱基序列，至少也要知道目的片段的部分序列，从而确定合成引物的碱基序列。6 U s9 q- k w% E
三、模板双链的解旋2 z5 X! ]2 m- a) O. g
在DNA的半保留复制机制中，双链DNA的解旋是在拓扑异构酶和解链酶的作用下完成的，该过程需要拓扑异构酶识别DNA的复制起点才能开启，而体外扩增特定的核酸片段只需要特异性的复制目的核酸片段，因而需要一种方式使得模板DNA解旋为单链DNA，之后在使之与引物结合，从而特异性的扩增目的核酸片段。% s, T% R( A3 Q6 d$ X" m
三、DNA的变性
& u' A" }' M$ [" j( A& ` DNA变性是指核酸双螺旋结构中碱基对的氢键断裂，使得双链变为单链的过程。
: p5 K. N0 _" [% w! \& } 对双链DNA进行加热可以使其发生变性，当温度升高到一定高度时，DNA在260nm处的吸光度会突然发生明显的上升，并达到最大值，之后温度继续上升，其吸光度也不会发生明显变化，若以温度对DNA溶液的260nm吸光度做图，会得到典型的DNA变性S型曲线。
- R7 B; A- N1 N7 }2 m2 i DNA的变性是在一个很窄的温度范围内发生的，通常将核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值50%时的温度称为核酸的熔解温度 (Tm, melting temperature)。
' G5 @9 o/ L* v$ P" a& T 1. 特定核酸分子的Tm值与其G+C含量成正相关，GC% = (Tm-69.3) × 2.44；; R1 W5 L9 T" E# V
2. Tm值的大小还与核酸分子的长度有关，核酸分子越长，Tm值越大；
: W3 h7 V5 `0 P" E" i0 b- j/ G7 ` 3. 粒子强度越高，熔解温度越高，熔解温度范围越窄。6 Z! M- a* s8 u
四、DNA的复性
, y$ [$ m2 W8 y 加热变性的DNA在缓慢冷却后可以由单链恢复为双链结构，这一过程称为DNA的复性，也称为“退火 (annealing)"。
& r, R% J' I2 J9 B5 _0 e; x 当温度降低至比变性DNA的Tm低25℃时，其复性效果*佳，越远离此温度，复性效果越差。% L0 r% d4 |- N- o+ a- T$ [* I
因此，可以利用此特性，在加热使模板DNA变性后，将温度降低至特定温度，从而使所加引物与模板DNA复性结合，进而能够对引物所规定的核酸片段进行特异性的扩增。% A( m) c( P) c2 `5 p. w2 v" r
五、DNA聚合酶; O) b6 u% Z% Z7 e4 n
为了使模板中特定的核酸片段进行扩增，在模板与引物结合后，需要有DNA聚合酶的参与，但是由于DNA变性和复性过程的温度较高，普通的DNA聚合酶在此过程中会由于温度过高而失活。( |1 f# N; U4 t3 x, ]/ b
科学家为了解决该问题，从水生栖热菌 (Thermus Aquaticus) 中分离出了具有热稳定性的DNA聚合酶，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活。
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