聚合酶链反应简称PCR(Polymerase Chain Reaction)，是以DNA半保留复制机制为基础，发展出的体外酶促合成、扩增特定核酸片段的一种方法。
5 x+ X2 e, a$ F* b) Q$ V 一、模板和底物
, u! p& s* Y- f& o; j DNA复制是模板依赖性的，必须以亲代DNA链作为模板，稳定细胞系构建亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。同时，DNA复制需要以四种脱氧核糖核苷酸，即dATP、dGTP、dCTP、dTTP，为底物合成子代DNA。0 u/ H5 h8 i8 k1 u5 h* K8 Q% g/ `
在体外进行DNA复制时，模板和底物均可通过人工添加解决。
0 r0 ^ ~. q3 d% m. a1 e0 i! u" {# t 二、引物* U" t; N O T y
DNA聚合酶必须以一段具有3’端自由羟基（3’-OH）的RNA作为引物，才能开始合成子代DNA链。
: d9 g+ U8 @: ^2 V( l1 d. r; T$ Q 在体外进行DNA复制时，可以人工合成具有特定序列的寡核苷酸作为引物，该引物序列与进行扩增的目的核酸片段互补匹配，从而开始目的片段的扩增。7 @3 g# _ D- f* Y/ i- v( t
因为引物的碱基序列需要与目的片段相匹配，在合成引物之前，必须首先已知目的片段的碱基序列，至少也要知道目的片段的部分序列，从而确定合成引物的碱基序列。& H9 U3 j- N* B% @6 H
三、模板双链的解旋# t7 o0 e4 E! m* m, L
在DNA的半保留复制机制中，双链DNA的解旋是在拓扑异构酶和解链酶的作用下完成的，该过程需要拓扑异构酶识别DNA的复制起点才能开启，而体外扩增特定的核酸片段只需要特异性的复制目的核酸片段，因而需要一种方式使得模板DNA解旋为单链DNA，之后在使之与引物结合，从而特异性的扩增目的核酸片段。
" C7 K7 Y `# E# \ 三、DNA的变性
" T) Z% k2 a; ^# G6 {/ v DNA变性是指核酸双螺旋结构中碱基对的氢键断裂，使得双链变为单链的过程。* d" a7 v+ P3 ]* x& p
对双链DNA进行加热可以使其发生变性，当温度升高到一定高度时，DNA在260nm处的吸光度会突然发生明显的上升，并达到最大值，之后温度继续上升，其吸光度也不会发生明显变化，若以温度对DNA溶液的260nm吸光度做图，会得到典型的DNA变性S型曲线。3 ~: G: P7 Y s6 i, T8 Y( |
DNA的变性是在一个很窄的温度范围内发生的，通常将核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值50%时的温度称为核酸的熔解温度 (Tm, melting temperature)。
2 a- N: M3 o, Y$ E 1. 特定核酸分子的Tm值与其G+C含量成正相关，GC% = (Tm-69.3) × 2.44；' ]. Q1 K8 p7 s. t1 q$ K5 u! G
2. Tm值的大小还与核酸分子的长度有关，核酸分子越长，Tm值越大；2 Q3 B% E+ K1 i, G% t4 y3 G
3. 粒子强度越高，熔解温度越高，熔解温度范围越窄。
% T: K$ k3 v/ c1 J; K3 d 四、DNA的复性
6 B! n# ]! R% } 加热变性的DNA在缓慢冷却后可以由单链恢复为双链结构，这一过程称为DNA的复性，也称为“退火 (annealing)"。* S! `6 s, p( E* [6 H- @$ }
当温度降低至比变性DNA的Tm低25℃时，其复性效果*佳，越远离此温度，复性效果越差。9 q7 f ?- s3 p8 Z9 q" c! h* S
因此，可以利用此特性，在加热使模板DNA变性后，将温度降低至特定温度，从而使所加引物与模板DNA复性结合，进而能够对引物所规定的核酸片段进行特异性的扩增。& u9 ~/ m! b+ e4 q" y8 ~
五、DNA聚合酶
1 A& x" K8 j6 h) @! o; {( |9 n 为了使模板中特定的核酸片段进行扩增，在模板与引物结合后，需要有DNA聚合酶的参与，但是由于DNA变性和复性过程的温度较高，普通的DNA聚合酶在此过程中会由于温度过高而失活。$ m5 M7 g; Q0 D) Y
科学家为了解决该问题，从水生栖热菌 (Thermus Aquaticus) 中分离出了具有热稳定性的DNA聚合酶，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活。+ }. K ^& K I, F
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