IND申报ELISA实验步骤及注意事项:# p8 Z; [$ z' j
1、固相载体选择
4 ^9 v0 O2 n: Q3 o$ Y& `! q 聚苯乙烯：具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。7 s. H* F2 l* q) F1 D& f" P
聚氯乙烯：聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高温物。
" e; G4 j6 i! Y" I1 O# }: D 良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。: F1 h8 y* }; J6 Y: k" {& x! h
2、包被) m( F5 f% j8 O/ e6 ?# }# c
①板孔的选择：ELISA配套的微孔板。; x) v% S" j; \
②抗体选择：何针选择支持ELISA实验的抗体，根据推荐浓度稀释或摸索最适浓度。
) o B" c% {: a, n# u ③包被缓冲液：pH9.6碳酸盐缓冲液或pH7.2磷酸盐缓冲液。& @. ]# _2 G2 s* M! V# G
④包被温度：2-8 ℃过夜包被或室温（37℃）包被2h。- [6 G7 O0 A) W3 Q k8 {& H0 T9 L1 t9 g
⑤包被浓度：包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化。一般包被浓度为10ug/ml-20ug/ml。' E1 `7 H6 S& k2 I- W% S8 ]
3、封闭
7 [6 R) n ~* U6 [$ X1 Q9 @ ①包被之后一定要立即封闭（封闭非特异性抗体）。# m3 p" V4 x( a* X
②选择效果较好的封闭剂（细胞培养级BSA、Tween等）。: a) g k, s$ X+ d
4、加样及孵育; O, e1 l$ Q- o
①加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。9 [5 t9 b! \' m% A# h+ P
②孵育的时间及温度参考试剂盒说明书。如有条件，建议加样孵育时使用shaker震荡仪，推荐轨道直径3mm，转速在500±50rpm。% q1 k `+ i3 w/ Q
③检测抗体、酶标物的稀释比例、孵育温度、孵育时间严格根据说明书提示。
, d8 b0 `% ]! W" ~ ④洗板对于ELISA来说，是极其关键的一步，保证ELISA的特异性。
0 t: I) B' C/ u% J0 t. x; z/ F ⑤封板膜一定要一次一换，切勿二次甚至多次使用，以防交叉污染。
/ H j" D. ?" [- ^ 5、显色和终材暗总止
6 C( s- |) m8 b' T, H( Q% I8 s ①使用前需检查，底物在加入96孔板之前应为无色透明。
- N3 A7 l; w* ^, { ②显色底物需现配现用，避免污染。
" n3 H/ \% m0 e ③孵育时间，说明书上为参考范围，具体需要根据实验条件自行摸索。可参考标曲浓度孔的颜色，变为蓝色较明显时即可。/ B" n" @+ u3 o1 `; i
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