生物药研发生产平台elisa试剂盒操作步骤：" l7 Y, p$ S" a0 w: Z# t
（1）待测样品孔中每孔加入待测样品100μl，每种样品设3个平行孔；设两个阴性对照孔，每孔加未处理组的细胞裂解液100μl；另设一个空白对照孔，加入纯细胞裂解液100μl。
0 [# q: J) t# G; K, V （2）酶标板置4℃，包被过夜。
; R0 ]% @) x5 ]9 M( D （3）洗板：吸干孔内反应液，用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去），之后将洗涤液注满板孔，浸泡1-2分钟，间歇摇动。甩去孔内液体后在吸水纸上拍干。重复洗涤3-4次。
3 { c: X% ^* R9 r8 {1 I* T （4）阴性对照孔每孔加入PBS 50μl，样品孔及空白孔每孔加入1:500稀释的兔抗人AIF抗体工作液50μl。
+ S3 u3 H3 C. V （5）酶标板置37℃培养箱的湿盒内，孵育60min。9 }: B0 a* y+ T8 f: o
（6）洗板，同（4）。8 p7 @7 T6 G0 v- K/ P0 `
（7）每孔加1:5000稀释的HRP-标记的山羊抗兔抗体工作液 100μl。
0 V4 U2 W; f2 S* j# O7 ` （8）酶标板置37℃培养箱的湿盒内，孵育60min。
) I1 G, Y4 r( O$ A: V2 u （9）洗板，同（4）。+ Q3 W: G% i( U6 |. ~0 s, ]
（10）每孔加TMB显色液 100μl，轻轻混匀10s，置37℃暗处反应15-20min。
8 |2 p( G. `- Z$ A& H （11）每孔加100μl 2mol/L H2SO4终止反应。) K3 N7 Q, Y# k; E; ^
（12）分别测450nm 吸光值W1和630nm吸光值W2，zui终测得的OD值为两者之差（W1-W2），以减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。! e5 l5 E6 E! b) {. p0 v$ X3 q
（13）数据处理：在得出标本（S）和阴性对照（N）的 OD值后，计算S/N值。S/N≥2.1为阳性判定标准。0 \6 y# C% ?, o7 P- u1 S- \
人elisa试剂盒注意事项：1 L$ c& H& S- l4 Z- k
1．边缘效应 使用96孔板的ELISA测定中，常发现有“边缘效应"，即外周孔显色较中心孔深。经研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的常规ELISA测定中，将板从室温（通常在25℃左右）置于37℃温箱，板也升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。因此使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（如37℃），就可以很容易地排除“边缘效应"，并且可提高测定的重复性。+ d# y6 ^) A% X5 O( F
2．加样在现在的ELISA商品试剂盒中，必然有使用微量加样器加入样本的步骤。注意的关键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。所以，有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。
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