生物药物研发服务测定原理:3 {: ]2 G' \6 M' D1 t: }/ b# Y
鸟氨酸和α-酮戊二酸在鸟氨酸转氨酶和NADH作用下发生氨基转移反应生成吡咯啉-5-羧酸（P5C），同时产生NAD，通过检测340nm处的吸光度的变化可反映出鸟氨酸转氨酶活性的高低。
2 k# v9 K+ y: H R 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
# N0 g0 R0 r$ R+ _ h# F) U* z 测定操作:
: R4 C! r, X: t5 p# R& j, b 1. 酶标仪预热30min，调节波长至340nm。* e4 ?7 t+ Y! l ~
2. 将配好的试剂二、三、四37℃预热5min。（注意：粉剂试剂需要自行配制）) Y/ p$ _- `( @+ I, L( O
3. 取96孔板，依次加入60μL试剂二，60μL试剂三，60μL试剂四，20μL粗酶液，充分混匀，记录340nm处初始吸光值和37℃反应10min的吸光值A2，△A=A1-A2。( s' V6 o- i' m( y* X# Q! R
4. 计算公式
' ]. S/ G8 W/ q+ C 用96孔板测定的计算公式如下* I0 I9 n D6 A- V |# r4 K
（1）按照样本蛋白浓度计算# c1 h9 F( K/ O# m; X. l
酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
! q+ o- K7 P) O3 K* U* n% G$ l δ-OAT（nmol/min /mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总÷(V样×Cpr) ÷T% W+ d1 e, Y( Y- S p
=321.54×ΔA÷Cpr
6 r9 n( v' d. s) k （2）按照样本质量计算. h2 X9 h3 y% h+ y
酶活单位定义：每克组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。/ L' V8 P/ G. y- Y4 G
δ-OAT（nmol/min /g 鲜重）=ΔA÷（ε×d）×V反总÷(W ×V样÷V样总) ÷T3 \; G) \ v4 J
=321.54×ΔA÷W
) V' M4 `7 \0 G; B4 w （3）按照细胞数量计算! E8 ? Y$ [+ _5 W
酶活单位定义：每104个细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
' j l' |( o: y/ T. V K δ-OAT（nmol/min /104 cell）= ΔA÷（ε×d）×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总) ÷T$ b; `1 v" ]. u7 `" @( n
=321.54×ΔA÷细胞数量$ X% H% i6 ?2 h: P( s% s
（4）按照液体体积计算
6 w7 Z# B3 a9 l! { 酶活单位定义：每毫升液体每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
/ ?6 q6 r4 F$ ~' }. w δ-OAT（nmol/min /mL）＝ΔA÷（ε×d）×V反总÷V样÷T
1 j) J( z* A. ^% Y- w =321.54×ΔA; `6 n5 G9 R) c: o
V反总：反应体系总体积，0.2mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g+ M5 l1 R. Z' @3 a* i8 L, s
测定意义:
- q I* D- v* n. `- Z7 s' h4 u' ^8 Z 脯氨酸是植物体内适应逆境胁迫的一种重要的渗透调节物质。高等植物中脯氨酸代谢因其初始底物不同，分为谷氨酸( Glu) 和鸟氨酸( Orn) 两条合成途径。鸟氨酸转氨酶( δ-OAT) 是 是以鸟氨酸为前体合成脯氨酸途径的关键酶，对植物适应逆境胁迫起关键作用。
% v! X0 Y) ^6 O( X" ]2 d, P1 j. D" t/ c6 `6 F& w! x) U4 I" S
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