生物药物研发服务测定原理:
8 s: Y U: `9 O8 b% | 鸟氨酸和α-酮戊二酸在鸟氨酸转氨酶和NADH作用下发生氨基转移反应生成吡咯啉-5-羧酸（P5C），同时产生NAD，通过检测340nm处的吸光度的变化可反映出鸟氨酸转氨酶活性的高低。# g3 {9 s g7 n
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
n W7 e0 m3 ?; O8 j! W) d+ C 测定操作:
9 I! ~7 W4 Q" v/ ]5 U4 A6 q 1. 酶标仪预热30min，调节波长至340nm。' p k& _6 F9 g: B/ }7 _3 V
2. 将配好的试剂二、三、四37℃预热5min。（注意：粉剂试剂需要自行配制）& Q" X: n0 _ J- E1 [" O# p: \
3. 取96孔板，依次加入60μL试剂二，60μL试剂三，60μL试剂四，20μL粗酶液，充分混匀，记录340nm处初始吸光值和37℃反应10min的吸光值A2，△A=A1-A2。; Q& V- F. v* Z- Q
4. 计算公式
1 N( W" G! i, B/ a 用96孔板测定的计算公式如下- k' q9 I2 d7 k' e/ d8 y! v
（1）按照样本蛋白浓度计算
$ C; C- R S X# [7 S; i% h. v 酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
% g$ v; P, |1 \( t2 F% z δ-OAT（nmol/min /mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总÷(V样×Cpr) ÷T, P. a+ ^( g: N8 {! ^
=321.54×ΔA÷Cpr* @ Y' P; f; {
（2）按照样本质量计算
- U$ [- F3 a7 _' o+ W" F- i( C 酶活单位定义：每克组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。" j0 q K6 m# c9 ~9 G+ t- i
δ-OAT（nmol/min /g 鲜重）=ΔA÷（ε×d）×V反总÷(W ×V样÷V样总) ÷T1 f" s! B. P5 I8 @, |$ a
=321.54×ΔA÷W
7 x; d" w0 q+ z1 R W, X （3）按照细胞数量计算
1 C3 Q% |6 S5 Y2 T8 h- E 酶活单位定义：每104个细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
' K+ F X9 K- H/ O δ-OAT（nmol/min /104 cell）= ΔA÷（ε×d）×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总) ÷T3 I4 [3 i: o8 ^' g, p
=321.54×ΔA÷细胞数量
) a5 C/ _8 U9 p7 C0 f q; W5 Z （4）按照液体体积计算
, ~: U' u- N8 s% {0 s 酶活单位定义：每毫升液体每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。2 L& K( ]6 j+ l
δ-OAT（nmol/min /mL）＝ΔA÷（ε×d）×V反总÷V样÷T
! B6 U' m( _4 W7 Y =321.54×ΔA) @: v6 ^) Z: h8 M
V反总：反应体系总体积，0.2mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g: ~$ a* A% h/ x8 r
测定意义:9 X% l% o0 l# _& `4 \" O9 ?9 w
脯氨酸是植物体内适应逆境胁迫的一种重要的渗透调节物质。高等植物中脯氨酸代谢因其初始底物不同，分为谷氨酸( Glu) 和鸟氨酸( Orn) 两条合成途径。鸟氨酸转氨酶( δ-OAT) 是 是以鸟氨酸为前体合成脯氨酸途径的关键酶，对植物适应逆境胁迫起关键作用。
0 a% Z2 `2 u6 d6 y! W, q4 ^
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