临床样品生产PCR反应条件三要素为温度、时间和循环次数。 5 @" c0 i n; L. C; w 温度与时间的设置 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。 }2 @, J5 ~. s! r- h `' U% C
1、变性温度与时间：2 b8 M( f. G L& ?
变性温度低，解链不完全是导致PCR 失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。5 D% K- Y+ N; S' o# M) J+ i" l$ K
2、退火(复性)温度与时间：# M: I J+ {1 k0 V
退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： 8 X8 k. o/ q% `; v: }7 e Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) ; l# e& W3 l$ p# T/ s4 W" w: i 复性温度=Tm值-(5～10℃), M; E6 ~+ e- f, I* k/ @4 t
在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。3 {1 s) k( U8 g% I5 o% U
3、延伸温度与时间：9 M4 q8 `5 ^4 h M6 B% @
Taq DNA聚合酶的生物学活性：* j. C8 w! u, A3 v. e
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 3 h* T: d& e/ F9 r4 C; v/ g! z4 h 70℃ 60核苷酸/S/酶分子+ L4 l0 \' S' u2 R
55℃ 24核苷酸/S/酶分子% w8 V. {& ]) L
高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。 m' x+ Z0 v% v- h4 ]) ? PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增 10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。% q+ [5 \: X. h
循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。9 k# T: a M G4 z
