抗独特型抗体ELISA试验广泛应用在免疫学检验的各领域中,那么ELISA试验有没有简单便捷的操作方法呢?0 S# \. u% H* @, @$ m% h7 }& J: t- }
方法一
1 q5 ~ |. ]& Y) R9 r 双抗体夹心法
1 G! L6 e# m" M! u; A 1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1——10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃ 过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。
. [3 }2 g; V+ `7 f- i 2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃ 孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。! K, @- H% y* z+ Z( t. N. ]# Y4 z4 S
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。37℃ 孵育0.5——1小时，洗涤。
, B0 G$ `9 Q0 z. U$ m 4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10——30分钟。
' h. l. I+ |" x i9 U. F 5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。2 h0 x' o% n+ Y
6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。( {* w8 N# `, w! C
方法二* y, j1 R# b) |0 c( {4 @
间接法
, H4 R* v- d4 w! ~ 1.用包被缓冲液将已知抗原稀释至1——10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜； `) A. W9 J& o! T' K
2.次日洗涤3次；/ k3 H7 V# [/ ]: q4 b9 C [
3.加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤；
: t X4 W: h- A 4.（同时做空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml；, i2 `0 m# D5 r" q% \- E U+ f
5.37℃孵育30-60分钟，洗涤；9 G" e" |0 t6 h% r. L* V4 k
6.’zui后一遍用DDW洗涤。7 L+ c$ D3 v1 C( M& ~) X, `
7. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10——30分钟。
# y2 d1 Z$ x4 m 8. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。; p7 p. w, R/ t8 e. W
9. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。& m+ W0 G+ p! h6 Y# c8 ~8 _7 R
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