抗独特型抗体ELISA试验广泛应用在免疫学检验的各领域中,那么ELISA试验有没有简单便捷的操作方法呢? z5 B' e8 a6 G. v7 H* r# F8 S* W; ?
方法一! {4 W/ K0 E3 d% j% v* v$ u$ C
双抗体夹心法
- {5 n n- u- V+ J" i 1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1——10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃ 过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。2 D. L' h- E. F/ ^" w% G% i4 ?
2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃ 孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。8 J1 Q' B8 A: V a. _
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。37℃ 孵育0.5——1小时，洗涤。
8 N p8 }- \$ d9 X( o! u 4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10——30分钟。! u: y/ m% f/ {0 E
5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。4 h( ~! Z& I/ K; U
6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。6 j: k1 e9 Z9 \* f2 s
方法二
" D. D, B9 A' b: g# b0 w$ s 间接法
' V+ i, r( g5 u9 J1 K 1.用包被缓冲液将已知抗原稀释至1——10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜；
: R: F* ^5 _- {' T" e4 k2 V 2.次日洗涤3次；. ` ~% k' W4 ~1 s4 C
3.加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤；& v( s L$ G& E, \$ N; h: P
4.（同时做空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml；: K! b. T" K( ^& W4 A8 T9 M+ u
5.37℃孵育30-60分钟，洗涤；! e. J% H' u- [5 p
6.’zui后一遍用DDW洗涤。1 K- y, Y% S8 Z! Z
7. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10——30分钟。) W% m6 x$ [& |" l! o* v" d
8. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。' B3 x/ X# }2 t+ e o9 S
9. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
* b/ a! A& H/ ~1 q) |
7 f( u# M" \# L3 t; m% H |
