抗独特型抗体ELISA试验广泛应用在免疫学检验的各领域中,那么ELISA试验有没有简单便捷的操作方法呢?
) u/ _: k1 c! E' M. s U& L" \) H 方法一$ ~9 ~- b' h) G. K" e& L* [
双抗体夹心法. u1 G& I/ D. T
1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1——10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃ 过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。; S0 z- V3 R: o# L* U* m. `
2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃ 孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。) |0 u( i5 L3 j7 e1 |0 r" x6 x
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。37℃ 孵育0.5——1小时，洗涤。0 p8 r# h# s$ n: U
4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10——30分钟。( s+ F' {6 ~' v# H
5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。9 _( y# ]% ?2 R2 {' y
6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
# p$ ~' u4 ?; X 方法二
; _' c; {$ P* r( y" A. f 间接法
$ w* c, K9 _; M' X4 e 1.用包被缓冲液将已知抗原稀释至1——10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜；$ g/ j0 C( ^& K- w$ I
2.次日洗涤3次；
# P) }7 g0 y4 A" v 3.加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤；
0 p6 {! Q7 j' L0 I0 m% y 4.（同时做空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml；
3 a0 R4 u5 U8 k5 m4 i 5.37℃孵育30-60分钟，洗涤；
5 e$ g6 y8 j) i: |, M0 _# x# G3 w 6.’zui后一遍用DDW洗涤。( B, Y Y: ]$ r/ q+ B4 _' p2 _
7. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10——30分钟。6 j& t( i5 u/ S7 J
8. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
1 i, O) h( p/ n4 F% ^ 9. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
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