在现在的ELISA商品试剂盒中,PV工艺表征血清样本的加入几乎是的要使用微量加样器加入样本的步骤.使用微量加样器加样必须注意的关键点是:加样不可太快,要避免加在孔壁上部,不可溅出和产生气泡.加样太快,无法保证微量加样的准确性和均一性.加在孔壁上部的非包被区,易导致非特异吸附.溅出会对邻近孔产生污染.出现气泡则反应液界面有差异.试剂的加入在国产试剂盒中基本上均是从滴瓶中滴加,除了要注意滴加的角度外,滴加的速度也很重要,滴加太快,很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象,这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附,从而引起非特异显色.所以,有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性,下次测定为阴性,往往就是上述加样及试剂的错误所致.$ D0 u) y% E% k
温育是ELISA测定中影响测定成败zui为关键的一个因素.ELISA作为一种固相免疫测定,抗原抗体的结合反应在固相上进行,要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原*结合,必须在一定的温度条件下反应一定的时间.温育所需时间与温度成反比,即温度越高,则所需时间相对较短.zui为常用的温育温度有37℃和室温,其次是43℃和2~8℃.& U1 O8 ^+ ~* e& n6 p3 Y
温育这一步是临床ELISA测定中容易出现问题的步骤.通常目前国内ELISA商品试剂盒的反应温育时间为37℃ 30分钟~1小时,进口elisa试剂盒则通常为37℃ 1~2小时才能有较*的结合,低于1小时,可能会影响测定下限.因此,关于温育,在实际测定操作中一定要注意以下几点:/ Y* D3 a. _) Y$ U1 s, e# A
(1)要保证在设定的温度下有足够的反应时间.一般来说,加完样本和/或反应试剂后,将微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时,孔内温度从室温升至37℃,需要一定的时间,尤其是在室温比较低以及非水浴的状态下,这段升温时间可能还比较长,而在临床实验室中,很少有人注意这个问题,通常是将微孔板一放入温箱即开始计时,这样就很容易造成实际测定中温育时间不够,弱阳性样本测不出来的问题.曾有一地处南方的血站同行提出了一个问题,就是在每一年的冬季总有那么一个多月的时间,在做HBsAg测定的室内质控中,测定由卫生部临床检验中心供应的1 ng/ml弱阳性样本时,总是测不出来,不知原因为何?这可能就与南方冬天室内温度较低有关,此时微孔板转入温箱后37℃温育时间不够,以致弱阳性样本测定为阴性.因此,为保证37℃下足够的温育时间,临床实验室可自行确定本实验室不同季节(不同室温下)微孔板从室温拿至温箱后需要多长时间孔内温度才能达到37℃,从而适当延长板条在温箱中的放置时间.具体的做法是,用一小温度计放置板孔反应溶液中测量观察即可.# d k+ E* s4 w5 J
(2)温育温度的选择.在有的ELISA试剂盒的说明书中,指出温育温度可有两种,例如,一种是37℃下1小时,另一种则为43℃下45分钟.从免疫测定的抗原抗体反应的本质来看,在较低的温度下反应较长的时间*为*.如2~8℃下反应24小时.较高的反应温度,由于分子运动的加怜惜,反应时间缩短,这一点对分子含量较多的强阳性样本的测定没有问题,但对分子含量少的弱阳性样本则有漏检的可能.因此,我们建议在临床ELISA测定中尽量使用较低温育温度较长反应时间的条件.
# L9 |5 P( b" B (3)“边缘效应”的排除.以前在使用96孔板的ELISA测定中,常发现有“边缘效应”,即外周孔显色较中心孔深,产生这种“边缘效应”的原因可能为96孔板周孔与中心孔表面或热力学特征的不同.但有研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因之所.聚苯乙烯本身为不良热导体,在实验室的常规ELISA测定中,将板从室温(通常在25℃左右)置于37℃温箱,板也升温时,在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度.因此使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时,将板和溶液均加热至温育温度(如37℃),就可以很容易地排除“边缘效应”,并且可提高测定的重复性.2 S: w& A8 r+ W0 i! z
总而言之,在实验ELISA测定中,要保证好的测定效果,可采用下述简单办法来确保温育条件,即尽量采用水浴,温育中让微孔板浮于水面上,或将浸透水的沙布放入一大饭盒中成一湿盒,放于温箱中,这样就会因为板条孔底部直接与37℃水或湿布的接触,以及水浴箱或湿盒内的高温度,而使反应溶液的温度迅速与温室平衡.. q, U$ s6 b; ^0 A2 C; h# m# c
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