污染向来是在细胞培养中的大问题。预防或治理污染是细胞培养成功的关键因素。我们在细胞培养时，双特异性抗体平台在开始阶段就要十分重视污染问题，否则会前功尽弃，这样不仅浪费时间，也会浪费人力、物力。6 I+ O" ?& M3 ]2 ]
(一) 有哪几类污染？6 N; k1 Q9 S# w ^
在细胞培养过程中的污染不只是指微生物，而且还包括所有混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括生物和化学物质。) Y0 G' l2 D9 V% t* d" n0 w0 Y
1、细菌污染
6 u, K% J+ ^0 v 细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素，也可能因为操作不慎而引起污染。见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。. j8 U% r/ g2 |/ p
2、真菌污染
* h/ A+ V4 o( [4 W' |0 }) V 真菌污染是细胞培养过程中见的一种，最的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。# N$ t( O, s9 W! P6 M/ T! `
3、支原体污染1 G9 P4 w ?- m1 }2 m8 A, E; m- D
支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。 培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。
$ n5 E6 B! B$ \* u5 h, J 4、非同种细胞污染. P# T+ ^" F- i; R: D6 x) o
由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。目前，世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。 细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生，大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不*而带入一些有毒化学物质所致。
% `3 a- s. k4 u& y" [( q （二）污染类型的区别
) r7 U& F5 l s 1、细菌、真菌污染的检测
+ S; ^0 z g1 o( i3 a (1) 肉眼观察 ---- 细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在48小时内可明显观察到，例如培养液变混浊，或略加振荡有很多漂浮物漂起。+ T3 C3 c/ |, k
(2) 接种观察 ---- 用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可发现是否有污染。, C% Q7 ~" ]! G9 D8 D+ e$ @8 K
(3) 镜下观察 ---- 倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。6 \# ]" I: C5 b7 @
2、支原体污染的检测
8 n9 H, H) `, W' e3 f) S( V (1) 相差显微镜观察 ---- 接取少许培养液滴在载物片上，再盖上盖片观察，支原体在镜下呈暗色微小颗粒，多位于细胞与细胞之间，有时可见类似于布朗运动的表现。注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区别。
, e) k. R/ \4 h" v9 d3 N, P v+ B (2) 荧光染色法观察 ---- 荧光染料Hoechst33258，此染料能与DNA特异地结合，可使支原体内的DNA着色，荧光显微镜下支原体呈绿色小点，散在于细胞周围或附于细胞表面。' ]4 h! r6 u7 O" W" X
(3) 电镜检测 ---- 条件许可，可用扫描电镜或透射电镜观察。一般在细胞培养48～72小时，细胞接近汇合前，用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行固定、包埋、切片后才能进行观察。3 L; E$ p O% g; X$ Y
(4) 培养检测 ---- 细胞悬液5mL加入45mL支原体肉汤培养基，培养14天后观察肉汤培养有无雾状沉淀，然后取0.5ml加入已冷却到50℃的培养基中，再用琼脂培养基做分离培养，37℃培养3天观察有无“荷包蛋”菌落出现。$ P; [; g6 i" }1 K" R
（三）病毒的检测
2 r: w) ~. c) z+ h+ o- l (1) 应用电镜技术快速诊断动物病毒病
. q( d6 h5 U v (2) 逆转录_聚合酶链反应RT_PCR检测病毒6 Q7 D$ h" \, Q
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