我们知道，在细胞培养检测实验在实验仪器、培养基等等工作上都要耗费不少的人力和体力。好在很久以前就有高人发明了细胞保存这个实验步骤，将暂时多出来的细胞冰冻保存，保存细胞活力。, {% Y) v# J+ o, w! p& r' _
1. 材料：
3 N% [* o9 Z+ {: X* T6 t4 W 生长良好之培养细胞、稳定细胞系构建服务新鲜培养基、DMSO (Sigma D-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0. 4%(w/v)trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)
! j6 R* Z- ]) E- F. R& b 2. 冷冻保存方法：
% |! A4 d$ ]+ j Q1 B7 K$ g, H9 @" R$ Q ①传统方法: 冷存管置于4 ℃10分钟--->-20 ℃30分钟--->-80 ℃ 16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。-20 ℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80 ℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
. z9 v* M! N7 x9 d$ n ②程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3 ℃/分钟之速度由室温降至(-80 ℃以下)-120 ℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。
+ v/ [: {, i, G# Q 3. 步骤：
9 K. o1 C9 [! [& L ①冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。
) f* o: @" F4 c ②配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜 (DMSO)至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。1 U2 F, I! |7 H, ^ L3 W
③离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0. 1 ml)计数细胞浓度及冻前存活率。' @' e* i% M- F. ]' @9 G, l" K: {1 J
④取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液(DMSO后浓度为5～10%)，使细胞浓度为1～5×106cells/ ml，混合均匀，分装于已标示*之冷冻保存管中，1～2 ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。; f$ |* N2 c; }7 ]. C
4. 注意事项：
& Y/ F3 ^& c5 i ①欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80～90%致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其*性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
* B' \) p/ f. T; r7 [' K ②细胞在液氮中可长期冻存无*，而不会影响细胞活力;在-70度可保存数月。
6 W- ]1 A. c4 [2 L! {3 U ③注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0. 22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5～10 ml小体积分装，4 ℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10%甘油冻存。
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