1. 包被过程(注意设置空白对照,阴性对照):5 h. z3 A; k/ i: i/ B2 \7 P
将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度(一般所需抗原包被量为每孔20-200μg),病毒CDMO每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;弃去孔中液体.(为避免蒸发,板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中)
7 e) y9 H& m+ ?5 a; @; { 2. 封闭酶标反应孔:
# n- Q$ T: `: `0 K9 G8 b 5%小牛血清置37℃封闭40min.封闭时将封闭液加满各反应孔,并去除各孔中的气泡,封闭结束后用洗涤液满孔洗涤3遍,每遍3min.
2 g# Q# y3 R! C1 Z- j 洗涤方法:吸干孔内反应液,将洗涤液注满板孔,放置2min略作摇动,吸干孔内液,倾去液体后在吸水纸上拍干。洗涤次数3次7 s$ C+ L4 |) `4 U% v; @6 F( \
3. 加入待检测样品(建立合适的浓度梯度):: j3 e t( |' ^& }6 G
检测时一般采用1:50-1:400的稀释度, 应采用较大稀释体积进行,一般保证样品吸取量>20μl.
7 Z8 c6 E; g G( M! U& z4 u 将稀释好的样品加入酶标反应孔中,每样品至少加双孔, 每孔100μl,置于37℃,40-60min.用洗涤液满孔洗涤3遍,每遍3min.6 B" J( i, w. P8 y3 G) x `1 b, a
4. 加入酶标抗体:
4 j% O/ s4 T& w 酶标抗体: 根据酶结合物提供商提供的参考工作稀释度进行. 37℃,30-60min之间.短于30min往往结果不稳定.每孔加100μl.洗涤同前。( x8 N2 M- g4 Z! z' D) `
5. 加入底物液(现用现配):& p2 p& J1 d- A( {9 d% N( r
TMB-过氧化氢尿素溶液,OPD-过氧化氢底物液系统次之.7 @* S9 M/ h$ C4 p8 J& B$ `
底物加入量:每孔100μl,置37℃避光放置3-5分钟,加入终止液显色.
, m Z7 W3 ^; o: r0 R3 _3 ` 6. 终止反应:; N/ E5 E) Q' o, N9 s$ a( n
每孔加入终止液50μl终止反应,于20min内测定实验结果. h4 O! v2 H2 J j% i3 V
7. 结果判断:
5 u3 d( m2 O( m) O5 b! { OPD显色后采用492nm波长,TMB反应产物检测需要450nm波长.检测时一定要首先进行空白孔系统调零.用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示,当P/N大于2时作为抗体的效价.(数值的大小依具体检测要求而定.)& V! y D! q1 t2 C0 D8 V" J, y
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