抗体人源化Elisa试剂盒竞争法测抗原的原理与步骤

heshao · 发表于 2023-04-20 19:51:18

　　抗体人源化Elisa试剂盒竞争法测抗原的原理与步骤
　　当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。
　　实验步骤
　　1.  以稀释液将待检标本做适当稀释（预试中确定）加入包被有已知抗原的酶标板中（50ul/孔），加封口胶带于37℃作用30min。
　　2.  弃反应液，以冲洗液连续洗板5次并于吸水纸上拍干。
　　3.  加入酶标抗体（浓度在预试中确定）。加封口胶带后于37℃作用30min。
　　4.  重复第2步。
　　5.  加底物（浓度在预试中确定），加封口胶带后于室温下避光作用5-60 min，其间不时观察，显色满意后加终止液50ul/孔。
　　6.  于酶标仪测定OD值，OPD用492nm测定，TMB用450nm测定。
　　注意事项
　　1.  每次实验均应做阴性对照、阳性对照及空白对照（以PBS代替标本），后者为本底值，在分析实验结果时应扣除本底值，阳性对照<阴性对照<空白对照实验成立。
　　2.  一般认为小分子抗原宜用本法检测，而大分子抗原则宜采用夹心法检测，但具体宜采用哪种方法应根据试验决定，本发与夹心法相比在操作上减少一步。包被抗体与酶标抗体如果分别采用单克隆抗体和多克隆抗体时，宜用单克隆抗体作为包被抗体，以多克隆抗体作为酶标抗体。
　　3.  血清标本中抗原浓度一般较低，故一般用原倍标本进行检测，必要时可进行稀释测定，但应重新摸索酶标抗原的浓度，以确保方法的灵敏性。
　　4.  以酶标记抗原的方法同酶标记抗体。
　　5.  其它注意事项同酶联免疫间接法。

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