聚合酶链反应简称PCR(Polymerase Chain Reaction)，是以DNA半保留复制机制为基础，发展出的体外酶促合成、扩增特定核酸片段的一种方法。0 p- I$ g) A$ b2 B8 Q; r
一、模板和底物
: x! g9 J5 P+ J" K# t4 Z' d DNA复制是模板依赖性的，必须以亲代DNA链作为模板，稳定细胞系构建亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。同时，DNA复制需要以四种脱氧核糖核苷酸，即dATP、dGTP、dCTP、dTTP，为底物合成子代DNA。% s8 b9 y1 e, H
在体外进行DNA复制时，模板和底物均可通过人工添加解决。
7 e- H2 w& A+ b8 `% K, w4 e# n1 o 二、引物
/ G! M3 X9 r+ r DNA聚合酶必须以一段具有3’端自由羟基（3’-OH）的RNA作为引物，才能开始合成子代DNA链。
& ?9 m* l! C+ H) z+ N) Z 在体外进行DNA复制时，可以人工合成具有特定序列的寡核苷酸作为引物，该引物序列与进行扩增的目的核酸片段互补匹配，从而开始目的片段的扩增。" n$ F: D$ x/ o/ S: b+ d% l: z
因为引物的碱基序列需要与目的片段相匹配，在合成引物之前，必须首先已知目的片段的碱基序列，至少也要知道目的片段的部分序列，从而确定合成引物的碱基序列。- u( h3 Y* i' [
三、模板双链的解旋1 |- Y% W/ W) D
在DNA的半保留复制机制中，双链DNA的解旋是在拓扑异构酶和解链酶的作用下完成的，该过程需要拓扑异构酶识别DNA的复制起点才能开启，而体外扩增特定的核酸片段只需要特异性的复制目的核酸片段，因而需要一种方式使得模板DNA解旋为单链DNA，之后在使之与引物结合，从而特异性的扩增目的核酸片段。9 h# z) x3 I' w( \5 e: m
三、DNA的变性
2 E& x N$ Y" ?" z5 }/ ^ DNA变性是指核酸双螺旋结构中碱基对的氢键断裂，使得双链变为单链的过程。% _- f- L/ ^0 `& y5 i% ^8 {
对双链DNA进行加热可以使其发生变性，当温度升高到一定高度时，DNA在260nm处的吸光度会突然发生明显的上升，并达到最大值，之后温度继续上升，其吸光度也不会发生明显变化，若以温度对DNA溶液的260nm吸光度做图，会得到典型的DNA变性S型曲线。 O# g/ L$ l' a$ s
DNA的变性是在一个很窄的温度范围内发生的，通常将核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值50%时的温度称为核酸的熔解温度 (Tm, melting temperature)。
6 M. x7 O, N, u; Z 1. 特定核酸分子的Tm值与其G+C含量成正相关，GC% = (Tm-69.3) × 2.44；
8 z- @( u2 x" I6 _5 e 2. Tm值的大小还与核酸分子的长度有关，核酸分子越长，Tm值越大；- d2 g1 h3 u9 L ^$ q4 w
3. 粒子强度越高，熔解温度越高，熔解温度范围越窄。7 Z, y: t- k8 R; J1 [) R0 [
四、DNA的复性
9 U T8 R' t* j: W; L1 X } 加热变性的DNA在缓慢冷却后可以由单链恢复为双链结构，这一过程称为DNA的复性，也称为“退火 (annealing)"。 I' ^6 Q1 Y7 ^2 w+ Z
当温度降低至比变性DNA的Tm低25℃时，其复性效果*佳，越远离此温度，复性效果越差。: {- x0 e2 S8 l4 z
因此，可以利用此特性，在加热使模板DNA变性后，将温度降低至特定温度，从而使所加引物与模板DNA复性结合，进而能够对引物所规定的核酸片段进行特异性的扩增。
; C' Q' ?8 K# z4 R8 ^: _8 R 五、DNA聚合酶 N2 d& M$ D M) ~0 ~! V6 r; s$ ]
为了使模板中特定的核酸片段进行扩增，在模板与引物结合后，需要有DNA聚合酶的参与，但是由于DNA变性和复性过程的温度较高，普通的DNA聚合酶在此过程中会由于温度过高而失活。
0 C& W+ }. v0 V5 t5 z/ x+ R8 `( ^ 科学家为了解决该问题，从水生栖热菌 (Thermus Aquaticus) 中分离出了具有热稳定性的DNA聚合酶，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活。% f" w5 S8 x! Y# R
# h! ]2 V) O6 e8 n
|
