PCR反应之DNA体外复制分析稳定细胞系构建

　　聚合酶链反应简称PCR(Polymerase Chain Reaction)，是以DNA半保留复制机制为基础，发展出的体外酶促合成、扩增特定核酸片段的一种方法。
- ]7 O, t1 S7 }% B5 y& e" i　　一、模板和底物
　　DNA复制是模板依赖性的，必须以亲代DNA链作为模板，稳定细胞系构建亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。同时，DNA复制需要以四种脱氧核糖核苷酸，即dATP、dGTP、dCTP、dTTP，为底物合成子代DNA。
; `: m9 z; ~. e7 G　　在体外进行DNA复制时，模板和底物均可通过人工添加解决。
% O; O" w7 @4 G/ I& F　　二、引物
: _3 P/ q# W4 `4 O3 \4 m　　DNA聚合酶必须以一段具有3’端自由羟基（3’-OH）的RNA作为引物，才能开始合成子代DNA链。
　　在体外进行DNA复制时，可以人工合成具有特定序列的寡核苷酸作为引物，该引物序列与进行扩增的目的核酸片段互补匹配，从而开始目的片段的扩增。
2 m; @9 _& q9 Q$ c　　因为引物的碱基序列需要与目的片段相匹配，在合成引物之前，必须首先已知目的片段的碱基序列，至少也要知道目的片段的部分序列，从而确定合成引物的碱基序列。
  G1 z# j4 T# X　　三、模板双链的解旋
　　在DNA的半保留复制机制中，双链DNA的解旋是在拓扑异构酶和解链酶的作用下完成的，该过程需要拓扑异构酶识别DNA的复制起点才能开启，而体外扩增特定的核酸片段只需要特异性的复制目的核酸片段，因而需要一种方式使得模板DNA解旋为单链DNA，之后在使之与引物结合，从而特异性的扩增目的核酸片段。
　　三、DNA的变性
　　DNA变性是指核酸双螺旋结构中碱基对的氢键断裂，使得双链变为单链的过程。
　　对双链DNA进行加热可以使其发生变性，当温度升高到一定高度时，DNA在260nm处的吸光度会突然发生明显的上升，并达到最大值，之后温度继续上升，其吸光度也不会发生明显变化，若以温度对DNA溶液的260nm吸光度做图，会得到典型的DNA变性S型曲线。
　　DNA的变性是在一个很窄的温度范围内发生的，通常将核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值50%时的温度称为核酸的熔解温度 (Tm, melting temperature)。
8 T5 ?# B7 {2 s! Q4 L　　1. 特定核酸分子的Tm值与其G+C含量成正相关，GC% = (Tm-69.3) × 2.44；
　　2. Tm值的大小还与核酸分子的长度有关，核酸分子越长，Tm值越大；
　　3. 粒子强度越高，熔解温度越高，熔解温度范围越窄。
% J( c& o, A% x1 j0 U　　四、DNA的复性
2 ]8 o% q$ Q, j' G) f　　加热变性的DNA在缓慢冷却后可以由单链恢复为双链结构，这一过程称为DNA的复性，也称为“退火 (annealing)"。
: V) \- f" `6 i8 ^& X" W1 w0 y　　当温度降低至比变性DNA的Tm低25℃时，其复性效果*佳，越远离此温度，复性效果越差。
" m) P+ o3 S3 M2 c/ Z; G　　因此，可以利用此特性，在加热使模板DNA变性后，将温度降低至特定温度，从而使所加引物与模板DNA复性结合，进而能够对引物所规定的核酸片段进行特异性的扩增。
　　五、DNA聚合酶
% {% b6 K6 }4 j* x　　为了使模板中特定的核酸片段进行扩增，在模板与引物结合后，需要有DNA聚合酶的参与，但是由于DNA变性和复性过程的温度较高，普通的DNA聚合酶在此过程中会由于温度过高而失活。
1 {1 r2 _2 j" B; t) {　　科学家为了解决该问题，从水生栖热菌 (Thermus Aquaticus) 中分离出了具有热稳定性的DNA聚合酶，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活。

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刚好遇到类似问题，看完这个帖子心里有底了

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完全赞同，我也是这么认为的，英雄所见略同～

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