以下是影响ELISA检测的关键因素，也是实验中经常出现问题及实用对策：, p* ~" R3 j" N+ \
1、为什么所有试剂和检测样本要平衡至室温后再进行加样操作？5 |( a, T8 ^; S9 m
灌流细胞培养温度是ELISA结合反应的重要影响因素。为了使所有样本在一致的温度下反应，实验前务必将所有试剂平衡至室温，包括检测样本。避免因温度的动力学反应差异而导致ELISA检测结果的不准确。 I6 n7 m6 E3 Z* g, _; a/ C
2、为什么标准曲线线性较差？. p4 Z1 q4 K$ _- b% K& {7 m" N) U# d
按照推荐方式保存标准品；溶解标准品之前需短暂离心，*收集粉末；确保标准品*溶解和混匀（大约10min），然后再进行后续的系列稀释步骤，确保每一步都充分混匀且精确移液；显色的恰当终止；选择合适的数学拟合方程绘制标准曲线。
( [7 l+ @% x7 q8 }$ P, i 3、ELISA实验为什么必须设置复孔？0 M& K1 y9 P! H9 } l: E1 ~, l
为获得更准确的实验结果，强烈建议标准品及样本进行复孔检测。
}/ `+ E1 ?3 d2 K! N- _ 因为复孔检测可以：$ w- I! p$ Q4 M2 c$ Y0 d8 ~
★计算平均值，确保实验结果更准确；0 ^) p7 d! z, P+ y* S! w6 A: p
★解决实验中误操作造成的跳孔现象；% \: D/ n4 ~, l+ f
★计算CV值，对实验的操作和试剂盒的精密度进行评估。% [# w, b4 K" e i- C
4、为什么实验过程中孵育、洗涤需要振荡？如何振荡？
7 K( v; c9 r$ D8 M, X 振荡孵育使反应更充分，振荡洗涤使背景更干净。建议使用酶标专用96孔微孔板振荡器。: ~+ {' `% ^# z* S
孵育过程振荡，可以加快、加强抗原抗体间的相互碰撞接触，使得反应过程更加*，OD值通常会比未振荡孵育的结果要高；洗涤过程振荡，可以使洗板更干净，在很大程度上能降低背景值，同时可以提高试剂盒检测的灵敏度。
' m* V" u' P8 s5 E 5、何时终止ELISA反应？
- F* s8 x n5 ~. J! K$ l4 S ELISA实验最终需要酶催化底物显色反应来完成，在最合适的时间终止反应是ELISA实验成功的重要因素。在HRP-TMB酶反应系统中，当最高浓度标准品颜色不再变深，倒数2-3个浓度标准品颜色开始有浅蓝色时，便需要终止反应；或者也可以根据最高浓度标准品孔在620nm的OD值来决定，OD620=0.9-0.95之间时即可终止。- E; G( S2 |5 t* R; T6 n
6、为什么酶标仪读数时必须选用双波长？$ o8 s8 V# Y4 x
首先，酶标仪使用前务必预热10-15min，使测读结果更稳定。其次，ELISA实验采用双波长测定吸光度，可以排除单波长检测时的测定干扰（标本的浓度，干扰色等）。一般采用最大波长作为参照波长，在参照波长下，检测物的吸光值最小，检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收；因此，双波长测定，可最大限度的消除指纹、杂质及不透光的物质对酶标仪读数带来的误差，以保证实验数据的准确度。 |
